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    鈣調結合蛋白elisa試劑盒的實驗原理及細胞培養步驟

    發布時間:2021-11-23   點擊次數:91次
      用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗MK抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗MK抗體、HRP標記的親和素,經過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MK呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。
      鈣調結合蛋白elisa試劑盒的細胞培養步驟
      1.培養基及培養凍存條件準備:
      1)準備RPMI-1640培養基(RPMI-1640:GIBCO,貨號21875-091);北美胎牛血清,20%;雙抗1%。
      2)培養條件:氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。溫度:37攝氏度,培養箱濕度為70%-80%。3)凍存液:90%血清,10%DMSO,現用現配。液氮儲存。
      2.細胞處理:
      1)復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養基后吹勻。然后將有細胞懸液加入培養瓶中培養*(或將細胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養基,培養*)。第二天換液并檢查細胞密度。
      2)細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養。對于貼壁細胞,傳代可參考以下方法:棄去培養上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mMEDTA)于培養瓶中,置于37℃培養箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。按6-8ml/瓶補加培養基,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
      3)細胞凍存:待細胞生長狀態良好時,可進行細胞凍存。下面T25瓶為例;細胞凍存時,棄去培養基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,細胞變圓脫落后,加入2ml完全培養基終止消化,可使用血球計數板計數。1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮,加DMSO至*終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻,按每1ml的數量分配到凍存管中,注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。將凍存管置于程序降溫盒中,放入-80度冰箱,至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
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